Javascript je trenutno onemogućen u vašem pretraživaču.Kada je javascript onemogućen, neke funkcije ove web stranice neće raditi.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Katalonija, Španija * Ovi autori imaju neke uvide u ovaj rad Equal Pozadina doprinosa: Hijaluronska kiselina (HA) je prirodni polisaharid koji se koristi u proizvodnji dermalnih filera u estetske svrhe.Pošto u ljudskim tkivima ima poluživot od nekoliko dana, dermalni fileri na bazi HA su hemijski modifikovani kako bi produžili svoj život u telu.Najčešća modifikacija u komercijalnim punilima na bazi HA je upotreba 1,4-butandiol diglicidil etera (BDDE) kao sredstva za umrežavanje za umrežavanje HA lanaca.Zaostali ili neizreagovani BDDE smatra se netoksičnim u <2 dijela na milion (ppm);stoga, preostali BDDE u konačnom dermalnom fileru mora biti kvantificiran kako bi se osigurala sigurnost pacijenta.Materijali i metode: Ova studija opisuje detekciju i karakterizaciju nusproizvoda reakcije umrežavanja između BDDE i HA u alkalnim uslovima kombinovanjem tečne hromatografije i masene spektrometrije (LC-MS).Rezultati: Nakon različitih analiza, ustanovljeno je da alkalni uslovi i visoka temperatura korištena za dezinfekciju HA-BDDE hidrogela pospješuju stvaranje ovog novog nusproizvoda, spoja nalik propilen glikolu.LC-MS analiza je potvrdila da nusproizvod ima istu monoizotopsku masu kao BDDE, različito vrijeme zadržavanja (tR) i različitu UV apsorbanciju (λ=200 nm).Za razliku od BDDE, u LC-MS analizi je uočeno da pod istim uslovima mjerenja, ovaj nusproizvod ima veću stopu detekcije na 200 nm.Zaključak: Ovi rezultati pokazuju da u strukturi ovog novog spoja nema epoksida.Otvorena je rasprava za procjenu rizika ovog novog nusproizvoda koji se nalazi u proizvodnji HA-BDDE hidrogela (HA dermalni filer) u komercijalne svrhe.Ključne riječi: hijaluronska kiselina, HA dermalni filer, umrežena hijaluronska kiselina, BDDE, LC-MS analiza, BDDE nusproizvod.
Fileri na bazi hijaluronske kiseline (HA) najčešći su i najpopularniji dermalni fileri koji se koriste u kozmetičke svrhe.1 Ovaj dermalni filer je hidrogel, obično sastavljen od >95% vode i 0,5-3% HA, što im daje strukturu nalik gelu.2 HA je polisaharid i glavna komponenta ekstracelularnog matriksa kičmenjaka.Jedan od sastojaka.Sastoji se od (1,4)-glukuronske kiseline-β (1,3)-N-acetilglukozamina (GlcNAc) ponavljajućih disaharidnih jedinica povezanih glikozidnim vezama.Ovaj disaharidni obrazac je isti u svim organizmima.U poređenju sa nekim filerima na bazi proteina (kao što je kolagen), ovo svojstvo čini HA visoko biokompatibilnim molekulom.Ovi punioci mogu pokazati specifičnost sekvence aminokiselina koju pacijentov imunološki sistem može prepoznati.
Kada se koristi kao dermalni filer, glavno ograničenje HA je njegov brzi obrt unutar tkiva zbog prisustva specifične porodice enzima zvanih hijaluronidaze.Do sada je opisano nekoliko hemijskih modifikacija u strukturi HA kako bi se produžilo poluživot HA u tkivima.3 Većina ovih modifikacija pokušava smanjiti pristup hijaluronidaze polisaharidnim polimerima umrežavanjem HA lanaca.Stoga, zbog formiranja mostova i intermolekularnih kovalentnih veza između strukture HA i sredstva za umrežavanje, umreženi HA hidrogel proizvodi više produkata razgradnje anti-enzima nego prirodni HA.4-6
Do sada, hemijska sredstva za umrežavanje korišćena za proizvodnju umreženog HA uključuju metakrilamid, 7 hidrazid, 8 karbodiimid, 9 divinil sulfon, 1,4-butandiol diglicidil eter (BDDE) i poli(etilen glikol) diglicidil etar.10 ,11 BDDE je trenutno najčešće korišteno sredstvo za umrežavanje.Iako je decenijama dokazano da su ove vrste hidrogelova bezbedne, korišćeni agensi za umrežavanje su reaktivni reagensi koji mogu biti citotoksični i, u nekim slučajevima, mutageni.12 Stoga njihov rezidualni sadržaj u konačnom hidrogelu mora biti visok.BDDE se smatra sigurnim kada je rezidualna koncentracija manja od 2 dijela na milion (ppm).4
Postoji nekoliko metoda za detekciju koncentracije niskog ostatka BDDE, stepena umrežavanja i položaja supstitucije u HA hidrogelovima, kao što su plinska hromatografija, hromatografija isključivanja veličine zajedno sa masenom spektrometrijom (MS), metode mjerenja fluorescencije nuklearne magnetne rezonance (NMR) i Tečna hromatografija visokih performansi sa spojenom nizom dioda (HPLC).13-17 Ova studija opisuje detekciju i karakterizaciju nusproizvoda u konačnom umreženom HA hidrogelu proizvedenom reakcijom BDDE i HA u alkalnim uslovima.HPLC i tečna hromatografija-masena spektrometrija (LC-MS analiza).Budući da je toksičnost ovog nusproizvoda BDDE nepoznata, preporučujemo da se kvantifikacija njegovog ostatka odredi na sličan način kao što se obično izvodi na BDDE u konačnom proizvodu.
Dobivena natrijumova so HA (Shiseido Co., Ltd., Tokio, Japan) ima molekulsku težinu od ~1.368.000 Da (Laurentova metoda) 18 i svojstveni viskozitet od 2,20 m3/kg.Za reakciju umrežavanja, BDDE (≥95%) je kupljen od Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, SAD).Fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom pH 7,4 nabavljen je od kompanije Sigma-Aldrich.Svi rastvarači, acetonitril i voda korišteni u LC-MS analizi su kupljeni od HPLC kvaliteta.Mravlja kiselina (98%) se kupuje kao reagens.
Svi eksperimenti su izvedeni na UPLC Acquity sistemu (Waters, Milford, MA, USA) i povezani na API 3000 trostruki kvadrupolni maseni spektrometar opremljen elektrosprej jonizacionim izvorom (AB SCIEX, Framingham, MA, SAD).
Sinteza umreženih HA hidrogelova započeta je dodavanjem 198 mg BDDE u 10% (w/w) rastvor natrijum hijaluronata (NaHA) u prisustvu 1% alkalije (natrijum hidroksid, NaOH).Konačna koncentracija BDDE u reakcionoj smjesi bila je 9,9 mg/mL (0,049 mM).Zatim je reakciona smeša temeljno promešana i homogenizovana i ostavljena da radi na 45°C tokom 4 sata.19 pH reakcije se održava na ~12.
Nakon toga, reakciona smjesa je isprana vodom, a konačni HA-BDDE hidrogel je filtriran i razrijeđen sa PBS puferom da bi se postigla koncentracija HA od 10 do 25 mg/mL, i konačni pH od 7,4.U cilju sterilizacije proizvedenih umreženih HA hidrogelova, svi ovi hidrogelovi se autoklaviraju (120°C 20 minuta).Prečišćeni BDDE-HA hidrogel se čuva na 4°C do analize.
Da bi se analizirao BDDE prisutan u umreženom HA proizvodu, uzorak od 240 mg je izvagan i uveden u središnju rupu (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, SAD; zapremina 0,5 mL) i centrifugiran na 10.000 rpm na sobnoj temperaturi 10 minuta.Sakupljeno je i analizirano ukupno 20 µL tečnosti za spuštanje.
Da bi se analizirao BDDE standard (Sigma-Aldrich Co) u alkalnim uslovima (1%, 0,1% i 0,01% NaOH), ako su ispunjeni sledeći uslovi, tečni uzorak je 1:10, 1:100 ili do 1:1,000,000 Ako je potrebno, koristite MilliQ deioniziranu vodu za analizu.
Za početne materijale korišćene u reakciji unakrsnog povezivanja (HA 2%, H2O, 1% NaOH i 0,049 mM BDDE), 1 mL svakog uzorka pripremljenog od ovih materijala analiziran je korišćenjem istih uslova analize.
Da bi se odredila specifičnost pikova koji se pojavljuju u ionskoj mapi, 10 µL standardnog rastvora BDDE od 100 ppb (Sigma-Aldrich Co) je dodano uzorku od 20 µL.U ovom slučaju, konačna koncentracija standarda u svakom uzorku je 37 ppb.
Prvo pripremite osnovni rastvor BDDE sa koncentracijom od 11.000 mg/L (11.000 ppm) razblaživanjem 10 μL standardnog BDDE (Sigma-Aldrich Co) sa 990 μL MilliQ vode (gustina 1,1 g/mL).Koristite ovu otopinu za pripremu otopine BDDE od 110 µg/L (110 ppb) kao srednjeg standardnog razrjeđenja.Zatim koristite srednji BDDE standardni razrjeđivač (110 ppb) da pripremite standardnu krivu razrjeđivanjem međurazrjeđivača nekoliko puta kako biste postigli željenu koncentraciju od 75, 50, 25, 10 i 1 ppb.Kao što je prikazano na slici 1, utvrđeno je da standardna kriva BDDE od 1,1 do 110 ppb ima dobru linearnost (R2>0,99).Standardna kriva je ponovljena u četiri nezavisna eksperimenta.
Slika 1 BDDE standardna kalibraciona kriva dobijena LC-MS analizom, u kojoj je uočena dobra korelacija (R2>0,99).
Skraćenice: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;LC-MS, tečna hromatografija i masena spektrometrija.
U cilju identifikacije i kvantifikacije BDDE standarda prisutnih u umreženom HA i BDDE standarda u osnovnom rastvoru, korišćena je LC-MS analiza.
Kromatografsko razdvajanje je postignuto na LUNA 2,5 µm C18(2)-HST koloni (50×2,0 mm2; Phenomenex, Torrance, Kalifornija, SAD) i držano na sobnoj temperaturi (25°C) tokom analize.Mobilna faza se sastoji od acetonitrila (rastvarač A) i vode (rastvarač B) koji sadrži 0,1% mravlje kiseline.Mobilna faza se eluira gradijentnim eluiranjem.Gradijent je sljedeći: 0 minuta, 2% A;1 minuta, 2% A;6 minuta, 98% A;7 minuta, 98% A;7,1 minuta, 2% A;10 minuta, 2% A. Vrijeme rada je 10 minuta, a volumen injekcije je 20 µL.Vrijeme zadržavanja BDDE je oko 3,48 minuta (u rasponu od 3,43 do 4,14 minuta na osnovu eksperimenata).Mobilna faza je pumpana pri brzini protoka od 0,25 mL/min za LC-MS analizu.
Za BDDE analizu i kvantifikaciju pomoću MS, UPLC sistem (Waters) je kombinovan sa API 3000 trostrukim kvadrupolnim masenim spektrometrom (AB SCIEX) opremljenim elektrosprej jonizacionim izvorom, a analiza se izvodi u režimu pozitivnih jona (ESI+).
Analizom jonskih fragmenata izvršenom na BDDE-u, za fragment najvećeg intenziteta utvrđeno je da je fragment koji odgovara 129,1 Da (slika 6).Stoga, u režimu praćenja više jona (MIM) za kvantifikaciju, konverzija mase (odnos mase i naelektrisanja [m/z]) BDDE iznosi 203,3/129,1 Da.Takođe koristi režim potpunog skeniranja (FS) i režim skeniranja jona proizvoda (PIS) za LC-MS analizu.
Kako bi se provjerila specifičnost metode, analiziran je slijepi uzorak (početna mobilna faza).Nije detektovan signal u slijepom uzorku sa konverzijom mase od 203,3/129,1 Da.Što se tiče ponovljivosti eksperimenta, analizirano je 10 standardnih injekcija od 55 ppb (u sredini kalibracione krive), što je rezultiralo rezidualnom standardnom devijacijom (RSD) <5% (podaci nisu prikazani).
Preostali sadržaj BDDE je kvantifikovan u osam različitih autoklaviranih BDDE umreženih HA hidrogelova, što odgovara četiri nezavisna eksperimenta.Kao što je opisano u odjeljku “Materijali i metode”, kvantifikacija je procijenjena prosječnom vrijednošću krivulje regresije standardnog razrjeđenja BDDE, što odgovara jedinstvenom piku otkrivenom pri tranziciji mase BDDE od 203,3/129,1 Da, sa zadržavanjem vrijeme od 3,43 do 4,14 minuta Bez čekanja.Slika 2 prikazuje primjer hromatograma referentnog standarda BDDE od 10 ppb.Tabela 1 sumira rezidualni sadržaj BDDE u osam različitih hidrogelova.Raspon vrijednosti je od 1 do 2,46 ppb.Stoga je rezidualna koncentracija BDDE u uzorku prihvatljiva za ljudsku upotrebu (<2 ppm).
Slika 2 Ionski hromatogram 10 ppb BDDE referentnog standarda (Sigma-Aldrich Co), MS (m/z) prelaz dobijen LC-MS analizom od 203,30/129,10 Da (u pozitivnom MRM modu).
Skraćenice: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;LC-MS, tečna hromatografija i masena spektrometrija;MRM, praćenje višestrukih reakcija;MS, masa;m/z, odnos mase i punjenja.
Napomena: Uzorci 1-8 su autoklavirani BDDE umreženi HA hidrogelovi.Preostala količina BDDE u hidrogelu i vrhunac vremena zadržavanja BDDE također su prijavljeni.Konačno, prijavljeno je i postojanje novih pikova sa različitim vremenima zadržavanja.
Skraćenice: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;HA, hijaluronska kiselina;MRM, praćenje višestrukih reakcija;tR, vrijeme zadržavanja;LC-MS, tečna hromatografija i masena spektrometrija;RRT, relativno vrijeme retencije.
Iznenađujuće, analiza LC-MS ionskog hromatograma je pokazala da je na osnovu svih analiziranih autoklaviranih uzoraka umreženog HA hidrogela postojao dodatni pik pri kraćem vremenu zadržavanja od 2,73 do 3,29 minuta.Na primjer, slika 3 prikazuje ionski hromatogram umreženog uzorka HA, gdje se pojavljuje dodatni pik u različitom vremenu zadržavanja od približno 2,71 minuta.Uočeno relativno vrijeme retencije (RRT) između novouočenog pika i pika iz BDDE je 0,79 (Tabela 1).Pošto znamo da se novouočeni pik manje zadržava u koloni C18 koja se koristi u LC-MS analizi, novi pik može odgovarati polarnijem spoju od BDDE.
Slika 3. Jonski hromatogram uzorka umreženog HA hidrogela dobijenog LC-MS (MRM konverzija mase 203,3/129,0 Da).
Skraćenice: HA, hijaluronska kiselina;LC-MS, tečna hromatografija i masena spektrometrija;MRM, praćenje višestrukih reakcija;RRT, relativno vrijeme retencije;tR, vrijeme zadržavanja.
Kako bi se isključila mogućnost da novi uočeni pikovi mogu biti zagađivači izvorno prisutni u korištenim sirovinama, ove sirovine su također analizirane korištenjem iste metode LC-MS analize.Analizirani početni materijali uključuju vodu, 2% NaHA u vodi, 1% NaOH u vodi i BDDE u istoj koncentraciji korištenoj u reakciji umrežavanja.Ionski kromatogram korištenog početnog materijala nije pokazao nikakvo jedinjenje ili pik, a njegovo vrijeme zadržavanja odgovara novom uočenom piku.Ova činjenica odbacuje ideju da ne samo da početni materijal može sadržavati bilo koje spojeve ili supstance koje mogu ometati proceduru analize, već nema znakova moguće unakrsne kontaminacije s drugim laboratorijskim proizvodima.Vrijednosti koncentracije dobijene nakon LC-MS analize BDDE i novih pikova prikazane su u tabeli 2 (uzorci 1-4), a ionski hromatogram na slici 4.
Napomena: Uzorci 1-4 odgovaraju sirovinama koje se koriste za proizvodnju autoklaviranih BDDE umreženih HA hidrogelova.Ovi uzorci nisu autoklavirani.
Skraćenice: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;HA, hijaluronska kiselina;LC-MS, tečna hromatografija i masena spektrometrija;MRM, praćenje višestrukih reakcija.
Slika 4 odgovara LC-MS hromatogramu uzorka sirovine korištene u reakciji umrežavanja HA i BDDE.
Napomena: Svi oni se mjere pri istoj koncentraciji i omjeru koji se koristi za izvođenje reakcije umrežavanja.Brojevi za sirovine analizirane hromatogramom odgovaraju: (1) vodi, (2) 2% vodenom rastvoru HA, (3) 1% vodenom rastvoru NaOH.LC-MS analiza je izvedena za konverziju mase od 203,30/129,10 Da (u pozitivnom MRM modu).
Skraćenice: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;HA, hijaluronska kiselina;LC-MS, tečna hromatografija i masena spektrometrija;MRM, praćenje višestrukih reakcija.
Proučavani su uslovi koji su doveli do formiranja novih pikova.Kako bi se ispitalo kako reakcioni uslovi koji se koriste za proizvodnju umreženog HA hidrogela utiču na reaktivnost BDDE agensa za umrežavanje, što dovodi do stvaranja novih pikova (mogućih nusproizvoda), izvršena su različita merenja.U ovim određivanjima proučavali smo i analizirali konačni BDDE umreživač, koji je tretiran različitim koncentracijama NaOH (0%, 1%, 0,1% i 0,01%) u vodenom mediju, nakon čega je uslijedilo ili bez autoklaviranja.Bakterijska procedura za simulaciju istih uslova ista je kao i metoda koja se koristi za proizvodnju umreženog HA hidrogela.Kao što je opisano u odjeljku “Materijali i metode”, tranzicija mase uzorka je analizirana pomoću LC-MS na 203,30/129,10 Da.Izračunati su BDDE i koncentracija novog pika, a rezultati su prikazani u tabeli 3. U uzorcima koji nisu autoklavirani nisu otkriveni novi pikovi, bez obzira na prisustvo NaOH u rastvoru (uzorci 1-4, tabela 3).Za autoklavirane uzorke, novi pikovi se detektuju samo u prisustvu NaOH u rastvoru, a čini se da formiranje pika zavisi od koncentracije NaOH u rastvoru (uzorci 5-8, tabela 3) (RRT = 0,79).Slika 5 prikazuje primjer ionskog hromatograma, koji prikazuje dva autoklavirana uzorka u prisustvu ili odsustvu NAOH.
Skraćenice: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;LC-MS, tečna hromatografija i masena spektrometrija;MRM, praćenje višestrukih reakcija.
Napomena: Gornji hromatogram: Uzorak je tretiran sa 0,1% vodenim rastvorom NaOH i autoklaviran (120°C 20 minuta).Donji hromatogram: Uzorak nije tretiran NaOH, već autoklaviran pod istim uslovima.Konverzija mase 203,30/129,10 Da (u pozitivnom MRM modu) analizirana je pomoću LC-MS.
Skraćenice: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;LC-MS, tečna hromatografija i masena spektrometrija;MRM, praćenje višestrukih reakcija.
U svim autoklaviranim uzorcima, sa ili bez NaOH, koncentracija BDDE je značajno smanjena (do 16,6 puta) (uzorci 5-8, tabela 2).Smanjenje koncentracije BDDE može biti posljedica činjenice da na visokim temperaturama voda može djelovati kao baza (nukleofil) za otvaranje epoksidnog prstena BDDE i formiranje 1,2-diolnog spoja.Monoizotopski kvalitet ovog jedinjenja je drugačiji od kvaliteta BDDE i stoga neće biti pogođen.LC-MS je otkrio pomak mase od 203,30/129,10 Da.
Konačno, ovi eksperimenti pokazuju da stvaranje novih pikova zavisi od prisustva BDDE, NAOH i procesa autoklaviranja, ali nema nikakve veze sa HA.
Novi pik pronađen u vremenu zadržavanja od približno 2,71 minuta je zatim okarakterisan LC-MS.U tu svrhu, BDDE (9,9 mg/mL) je inkubiran u 1% vodenom rastvoru NaOH i autoklaviran.U tabeli 4, karakteristike novog pika su upoređene sa poznatim referentnim pikom BDDE (vrijeme zadržavanja približno 3,47 minuta).Na osnovu analize jonske fragmentacije dva pika, može se zaključiti da pik sa vremenom zadržavanja od 2,72 minuta pokazuje iste fragmente kao i BDDE pik, ali različitog intenziteta (slika 6).Za vrh koji odgovara vremenu zadržavanja (PIS) od 2,72 minuta, intenzivniji pik je uočen nakon fragmentacije pri masi od 147 Da.Pri koncentraciji BDDE (9,9 mg/mL) korištenoj u ovom određivanju, različiti modovi apsorpcije (UV, λ=200 nm) u ultraljubičastom spektru također su uočeni nakon hromatografskog odvajanja (Slika 7).Pik sa retencionim vremenom od 2,71 minuta je i dalje vidljiv na 200 nm, dok se BDDE pik ne može uočiti na hromatogramu pod istim uslovima.
Tabela 4 Rezultati karakterizacije novog pika sa vremenom zadržavanja od oko 2,71 minuta i BDDE pika sa vremenom zadržavanja od 3,47 minuta
Napomena: Da bi se dobili ovi rezultati, obavljene su LC-MS i HPLC analize (MRM i PIS) na dva pika.Za HPLC analizu koristi se UV detekcija sa talasnom dužinom od 200 nm.
Skraćenice: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;HPLC, tečna hromatografija visokih performansi;LC-MS, tečna hromatografija i masena spektrometrija;MRM, praćenje višestrukih reakcija;m/z, odnos mase i punjenja;PIS, ionsko skeniranje proizvoda;ultraljubičasto svjetlo, ultraljubičasto svjetlo.
Napomena: Fragmenti mase su dobijeni LC-MS analizom (PIS).Gornji kromatogram: maseni spektar fragmenata BDDE standardnog uzorka.Donji hromatogram: Detektovani maseni spektar novog pika (RRT povezan sa BDDE pikom je 0,79).BDDE je obrađen u 1% rastvoru NaOH i autoklaviran.
Skraćenice: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;LC-MS, tečna hromatografija i masena spektrometrija;MRM, praćenje višestrukih reakcija;PIS, ionsko skeniranje proizvoda;RRT, relativno vrijeme retencije.
Slika 7. Jonski hromatogram jona prekursora od 203,30 Da i (A) novi pik sa vremenom zadržavanja od 2,71 minuta i (B) UV detekcija referentnog standardnog pika BDDE na 3,46 minuta na 200 nm.
U svim proizvedenim umreženim HA hidrogelovima, uočeno je da je rezidualna koncentracija BDDE nakon LC-MS kvantifikacije bila <2 ppm, ali se u analizi pojavio novi nepoznati vrh.Ovaj novi vrh ne odgovara standardnom proizvodu BDDE.BDDE standardni proizvod je također prošao istu konverziju kvaliteta (MRM konverzija 203,30/129,10 Da) analizu u pozitivnom MRM modu.Generalno, druge analitičke metode kao što je hromatografija koriste se kao granični testovi za otkrivanje BDDE u hidrogelovima, ali maksimalna granica detekcije (LOD) je nešto niža od 2 ppm.S druge strane, do sada su NMR i MS korišteni za karakterizaciju stepena umrežavanja i/ili modifikacije HA u fragmentima jedinica šećera umreženih HA proizvoda.Svrha ovih tehnika nikada nije bila kvantifikovati detekciju rezidualnog BDDE pri tako niskim koncentracijama kao što smo opisali u ovom članku (LOD naše LC-MS metode = 10 ppb).
Vrijeme objave: Sep-01-2021